ESCHERICIA COLI

ESCHERICIA COLI

 Metode APM (Angka Paling Mungkin)

Prinsip :

Pertumbuhan E.Coli yang di tandai oleh terbentuknya gas didalam tabung Durham setelah di inkubasikan dalam perbenihan yang cocok pada suhu 44^oC selama 24-48 jam, yang di ikuti oleh uji biokimia dan selanjutnya di rujuk pada tabel APM.

  Landasan Teori :

E-Coli

E.Coli adalah baktri coliformyang sering ditemukan pada faces manusia dan hewan berdarah panas. Organisme ini tersebar luas di alam biasanya lazim terdapat dalam sel pencernaan manusia dan hewan. Dalam Merchant dan Parker (1961)  disebutkan spesies E. coli tidak dapat mengurangi asam sitrat dan  garam  asam  sitrat  sebagai  sumber  karbon  tunggal  dan  tidak menghasilkan  pigmen,  tetapi  kadang-kadang  menghasilkan  pigmen berwarna kuning.

Klasifikasi Escherichia coli :

Divisio             :           Schizomycota

Kelas                :           Schizomycetec

Ordo                :           Eubacteriaceae

Genus               :            Escherichia

Species             :           Escherichia coli (Salle, 1961)

E. coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Meskipun demikian, beberapa jenis E. coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe yang masuk dalam golongan E. coli Enteropatogenik, E.coli Enteroinvasif, E. coli Enterotoksigenik dan E.coli Enterohemoragik . Jadi adanya E. coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum tersebut pernah terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karenanya standar air minum mensyaratkan E. coli harus absen dalam 100 ml.

Berbagai cara pengujian E. coli telah dikembangkan, tetapi analisis konvensional yang masih banyak dipraktekkan adalah dengan 4 tahap analisis yang memerlukan waktu 5-7 hari. Empat tahap analisis tersebut adalah Uji Pendugaan dengan metode MPN ( most probable number ), Uji penguat pada medium selektif, Uji lengkap dengan medium lactose broth, serta Uji Identifikasi dengan melakukan reaksi IMViC (indol, methyl red, Vogues-Praskauer, dan citrate). Jadi untuk dapat menyimpulkan E. coli berada pada air atau makanan diperlukan seluruh tahapan pengujian di atas. Apabila dikehendaki untuk mengetahui serotipe dari E. coli yang diperoleh untuk memastikan apakah E.coli tersebut patogen atau bukan maka dapat dilakukan uji serologi. Meskipun demikian, beberapa serotipe patogen tertentu seperti O157:H7 yang ganas tidak dapat diuji langsung dengan pengujian 4 tahap ini dan memerlukan pendekatan analisis khusus sejak awal.

E. coli tersebar diseluruh dunia dan ditularkan bersama air atau makanan yang terkontaminasi oleh feses. Escherichia coli berbentuk batang,  tebal  0,5µ m;  panjang  antara  1,0  -  3,0  µ m;  bervariasi  dari bentuk koloid  sampai berbentuk seperti filamen yang panjang; tidak berbentuk  spora;  motil  dan  filamen  perithin  beberapa  galur  tidak memiliki flagella; bersifat Gram negatif (Merchant dan Parker, 1961).

E.  coli  bersifat  aerob  atau  kualitatif  anaerob,  dapat  tumbuh pada  media  buatan.  Beberapa  sifat E.  coli antara lain pertumbuhan optimum  pada  suhu  37ºC,  dapat  tumbuh  pada  suhu  15ºC  -      45ºC, tumbuh baik pada pH 7,0 tapi tumbuh juga pada pH yang lebih tinggi (Merchant dan Parker,1961)

Koloni  terlihat  basah,  mengkilat,  tidak  bening,  bulat  dan dengan tepi yang terlihat halus dan rata. Koloni muda terlihat granuler halus   dan   makin   tua   menjadi   granuler   kasar.   Escherichia   coli menghasilkan asam  dan gas dari glukosa, laktosa, fruktosa, maltosa, arabinosa,            xylosa, rhamnosa      dan manitol; dapat atau tidak memfermentasi sukrosa, rafinosa, salisin, eskulin, dulsitol dan gliserol; bervariasi  dalam   memfermentasi  sakrosa  dan  salisin,  pektin  dan adonitol  jarang   difermentasikan;  dekstrin,  pati  dan  glikogen  dan inositol tidak pernah difermentasikan (Merchant dan Parker, 1961).

Escherichia  coli  menghasilkan  katalase,   tidak   mencairkan gelatin,    membentuk   indol,mereduksi nitrat,mengoksidasi dan mengasamkan air susu tanpa   peptonisasi,mengoksidasi kentang sehingga berwarna coklat gelap,tidak menghasilkan gas   H2S (Merchant dan Parker, 1961).

Peralatan :

a.      Penangas air

b.      Waterbath Inkubator 44-45^oC

c.       Pipet Volume 1 mL, 10 mL

d.      Ose

e.      Labu Erlenmeyer

f.        Tabung Reaksi

 Perbenihan dan pereaksi

a.      Eschericia Coli Broth (EC Broth)

b.      BGLB Broth

c.       EMB Agar

d.      MR-VP Medium

e.      Nutrient Agar (NA)

f.        Larutan Methyl Red

g.      Pereaksi Voges Proskauer

h.      Pereaksi untuk Pewarnaan Gram

i.        Pereaksi Indol

j.        Larutan alfa-Naphtol

k.       Larutan KOH 40%

Cara Kerja :

a)      Masukkan 1 sengkelit biakan yang positif gas pada LB dan pengujian APM bakteri Coliform kedalam tabung berisi E.C Broth yang di dalamnya terdapat tabung durhamterbalik.

b)      Inkubasikan dalam penangas air pada suhu 44-45^oC selama 24-48 jam.

c)      Catat tabung yang didalamnya terbentuk gas (E.Coli dianggap positif, jika di dalam tabung terbentukgas).

d)      Lanjutkan penetapan E.Coli dengan menginokulasikan biakan yang membentuk gas ke perbenihan EMB atau VRBA dalam cawan petri.

e)      Inkubasikan pada suhu 37^oC selama 18-24 jam.

f)       Pilih koloni berwarna merah gelap (VRBA) yang berdiameter 0,5 mm atau lebih atau koloni berwarna kilat logam hijau metalik (EMB Agar) dan di inokulasikan pada

g)      Nutrien Agar miring dalam tabung, Inkubasikan pada suhu 35^oC selama 18-24 jam.

Pada waktu yang sama lakukan pewarnaan gram sebagai berikut :

a.      Buat sediaan diatas kaca alas. Keringkan di udara dan fiksasikan dengan panas. Wamal sediaan dengan larutan cristal Violet ammonium Oxalate selama 1 menit. Cuci dengan air dan tiriskan. Bubuhkan larutan Lugol (Gram iodium) selama 1 menit. Cuci dengan air kran dan tiriskan. Cuci (Hilangkan warna) dengan alkohol 95% selama 30 detik. Cuci dengan air kran, tiriskan dan bubuhkan larutan safranin selama 10-30 detik. Cuci dengan air kran, tiriskan, serap dengan kertas saring, keringkan dan periksa dibawah mikroskop.

Pengujian IMVIC :

a)      Uji Indol

Dari biakan murni nutrien agar miring, inkubasikan 1 sengkelit Biakan kedalam Trypton broth. Inkubasikan pada suhu 35^oC selama 18-24 jam. Tambahkan 0,2-0,3 ml pereaksi indol kedalam masing-masing tabung dan kocok selama 10 menit. Warna merah tua pada permukaan menunjukkan reaksi indol positif. Warna jingga menunjukkan reaksi indol negatif.

b)     Uji merah Methyl

Dari biakan murni nutrien agar miring, inokulasikan 1 sengkelit biakan kedalam perbenihan MR-VP. Inkubasikan pada suhu 35^oC selam 48 jam. Dengan menggunakan pipet, pindahkan 5 ml ke dalam tabung reaksi, tambahkan 5 tetes MM dan kocok. Warna kuning menunjukkan reaksi negatif dan warna merah menunjukkan reaksi positif.

c)      Uji VP

Dari biakan murni nutrien agar miring, inokulasikan 1 sengkelit biakan kedalam perbenihan MR-VP. Inkubasikan pada suhu 36^oC selama 48 jam. Dengan menggunakan pipet, pindahkan 1 ml suspensi kedalam tabung, jtambahkan 0,6 ml larutan alfa-naphtol dan 0,2 ml larutan KOH dan kocok. Diamkan selama 2-4 jam. Warna merah muda hingga merah tua menunjukkan reaksi positif, warna tidak berubah menunjukkan reaksi negatif.

Ø  Hasil dinyatakan sebagai berikut :

·         Diamati terbentuknya gas dalam tabung durham. Jika terbentuk gas, dengan menunjukkan ke tabel Angka Paling mungkin, dapat dinyatakan APM E.Coli.

·         Ditegaskan hasil uji pewarnaan gram dan reaksi biokimia. Jika pewarnaan gram menunjukkan adanya bakteri berbentuk batang dan warna merah muda (gram negatif) serta reaksi biokimia menunjukkan uji indol dan merah metil positif, dan uji VP negatif, dapat dinyatakan penegasan adanya E.Coli

·         Hitung APM E.Coli per gram atau mililiter contoh dengan menggunakan tabel APM.

Vibrio Cholerae - Determination Of Vibrio Cholerae in the Milk Sample

Microbiologi Report

Purpose                       : To determination number of Vibrio Cholerae bacterium in the milk  sample                                                

Principle                     :
Growth of Vibrio cholerae is characterized by the formation of yellow colonies on media TCBSA obtained and incorporated into the NA media, incubated at 37 ℃ for 24v hours. Suspense was transferred to the TSIA and VP of media were incubated at 37 ℃ for 24 hours.

  

Theorical Basic :

Vibrio Cholerae

Vibrio cholerae is a gram-negative bacteria, shaped bacilli (rod) and are motile (can move), has the structure of the antigen flagelar antogenik H and O somatic antigen, gamma-proteobacteria, mesophilic and kemoorganotrof, berhabitat naturally in aquatic environments and is commonly associated with eukaryotic . The species is frequently associated with Vibrio patogenisitasnya properties in humans, especially V. cholerae causes cholera disease in developing countries which have limitations for clean water and have poor sanitation.
Scientific classification :
Kingdom          : Bacteria
Phylum            : Proteobacteria
Class                : Gamma Proteobacteria
Order              : Vibrionales
Family             : Vibrionaceae
Genus              : Vibrio
Species            : V.cholerae

These bacteria can grow in media with high pH (9 to 9.5); can ferment glucose, lactose & fructose without the aid of acid sulfide; grown on media containing thiosulfate, citric & gall; active motility; positive oxidase reaction on the test; grams negative; curved rod-shaped; has several types based on antigenic differences in the O-antigen, three of this type is the Inaba, Ogawa & hikojima. Power is transmitted bacterial pathogen as dirt mouth disease and acquired by ingestion of contaminated food & water impurities. These organisms are not spread beyond the gastrointestinal tract, where the organisms have multiplied to a very high concentration in the small intestine and colon. Vibrio cholerae remain firmly attached to the intestinal mucus layer.

To perform the isolation and maintenance of vibrio, can use the media Thiosulfate-citrate-bile salts agar (TCBS) which is a selective medium for the isolation and purification of Vibrio. Vibrio able to use sucrose as a carbon source is yellow, while the other is green.

However, there are several microbial that can also grow on this medium, such as Staphylococcus, Flavobacterium, Pseudoalteromonas, andShewanella. [2] As for the multiplication of Vibrio, the media can use Alkaline Peptone Water (APW), which has a relatively high pH, ​​which ranges 8.4 and containing 1-2% NaCl. [2] The vibrio is the optimum growth at temperatures ranging between 20 - 35^oC.

Techniques used in the identification of phenotypes V. cholerae is a test of lysine and ornithine decarboxylase (arginine) decarboxylase, oxidase, Kliger Iron Agar (KIA), and indole test. V. cholerae will show positive results on these four biochemical tests. The results of testing positive for oxidase and lysine and arginine decarboxylase test is the formation of dark purple color. At the MCH test, no gas is formed, with a slant (the surface of the media), color red (alkaline) and butt (bottom medium) yellow (acidic). For the indole test, purplish-red color is formed on the surface. Vibrio cholerae (V. cholerae) is a gram-negative, short rod-shaped or comma, can ferment sucrose on TCBS media and be able to move because of the polar flagella.

Media

Media is a collection of organic substances that are used to grow bacteria with certain conditions, therefore the culture media should contain enough nutrients for bacterial growth (Jackson, 2000). In addition to temperature and pH should be appropriate (Karsinah et al, 1994) is also worth noting about the pressure of osmose and sterility (Anonymous, 2000).
Media is distinguished over the shape, structure, and properties of the media:
a. According to the known shape of :
1. Solid media, if media is added in between 12-15 grams of agar-agar powder / 1000 ml of media.
2. Liquid media, if the substance is not added into the media junkie.
3. Semisolid or semi-liquid, if the addition of compactor only 50% or less than it should.
b. According to its structure:
1. Natural media, the media are prepared by natural ingredients.
2. Synthesis media, ie media prepared by chemical compounds.
3. Semi-synthetic media, the media are composed of natural materials and semi-synthetic ingredients.
c. According to its nature:
1. General media, the media can be used for growth and development of one or more groups of microbes.
2. Rich media, to get the growth of certain types of bacteria that do not grow on simple media.
3. Selective media, ie media covered only zero or one particular type of microbe, but will inhibit or lethal to other strains that are not expected. Media eg MSA (Mannitol Salt order).

Media TCBSA

Erlenmeyer containing 300 ml of distilled water, sterilized in an autoclave, then didindingkan. TCBSA media weighed as much as 26.4 grams put into Erlenmeyer that has been sterilized. Then the Erlenmeyer containing media reheated over a water bath to dissolve all. Then the media is poured into petridisk then cooled.
 

Tools and Materials :

Ø Tools :

Test tube
Petrididk
600 ml beaker
Pipette 10 ml scale
300 ml Erlenmeyer
Enkas
Ose
Incendiary spritus
Laminar flow of water

Ø Material :

Media TCBSA
Media NA
Media TSIA

Procedures :

-          10 ml sample pipetted into Erlenmeyer syrup containing diluent solution APW, Kemudiuan incubated for 1-2 x 24 hours at 37 ℃.

-          Then a solution of APW ± 1ml pipetted into the medium and then scratched TCBSA
After that TCBSA media that already contains the sample incubated for 1-2x24 hours at 37 ℃

-          Then the formed colonies were observed when yellow, it means that the positive
Of culture on media TCBSA the scratched on NA media, incubated 1-2 x 24-hour diving [at 37 ℃

-          Of culture on NA media taken 1 sengkelir OSE and the scratched on sloping TSIA aga and VP inkubasikan an x24-hour immersion at 37 ℃

-          After incubation time, into the VP was added 0.6 ml laruta \ n alpha naphtol and 0.2 ml of aqueous KOH

Observation : 

In TCBSA media were incubated for 1 x 24 hours at a temperature of 370c formed yellow colonies (+).
In biochemical tests were incubated 24 hours at a temperature dive 370c in which the media TSIA and VP positive.

Conclusion:

From the above observations it can be concluded that the samples of milk powder on testing Vibrio Cholera, yellow colonies formed TCBSA media and on biochemical tests TSIA and VP positive.